此外，马来西亚联邦成立的第二年举行了大选，以李光耀领导的新加坡人民行动党和联邦政府发生对立，特别是新加坡接连发生两次华族和马来亚族大规模种族冲突后，新加坡地区立即被宣布为危险地区。马来西亚中央政府同新加坡自治政府关系越来越紧张，担心随着新加坡加入马来西亚，将激化马来西亚的种族矛盾，引发冲突，所以要求把新加坡赶出马来西亚联邦的呼声日益加剧，李光耀被指责为分裂主义者，被指责为要把马来西亚联邦分裂成“一个马来人的马来西亚，一个李光耀的马来西亚”。马来西亚当时的国家元首东姑阿都拉曼曾在反对殖民主义、创立马来西亚联邦的斗争中与李光耀并肩战斗过，不过他被李光耀的好斗激怒，并在1965年决定把新加坡赶出马来西亚联邦，1977年东姑阿都拉曼在他写的《回顾》一书提到他们之间的分歧与斗争，而且送给李光耀一本，还在书扉页上写道:“送给对马来西亚的创立异常卖力，对马来西亚的分裂更加卖力的朋友李光耀先生”。1965年8月7日，马来西亚通知新加坡，要求它退出马来西亚，第三天，即8月9日，双方同时宣布，新加坡脱离马来西亚，成为独立的国家，同年12月，新加坡立法议会通过宪法修正案，成立新加坡共和国，尤素福·伊萨出任首任总统，李光耀出任总理。李光耀在8月9日宣布新加坡独立的大会上，曾为新马分裂，为新加坡茫茫前途，为留在马来西亚的支持者可能受到的遭遇而痛哭过，他在1998年出版的回忆录中说:“我从来没有这么悲伤过，分家成了事实，我辜负了马来亚、沙巴和砂劳约的许许多多人，他们响应了我们的号召，主张成立马来西亚人的马来西亚。……而我却接受了分家，使他们失望，内疚使我情不自禁地痛哭起来。”

新加坡共和国正式成立后，虽然遇到许多风浪与曲折，但在李光耀的领导下，新加坡人民开始走上独立自主建设国家的康庄大道，翻开了历史新篇章。